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豬血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒

 (用于血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))

原理

本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗豬 VEGF 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 VEGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗豬VEGF，形成**復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，*后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，VEGF濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中VEGF濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1.         收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.         標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成40ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，**管加標(biāo)本稀釋液900ul，**至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在**管中加入40ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至**管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.         10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.     洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序

1.         加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.         洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.         每孔中加入**抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.         洗板：同前。

5.         每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.         洗板：同前。

7.         每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.         每孔加入100ul終止液混勻。

9.         30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

結(jié)果計算與判斷

1.         所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。

2.         以標(biāo)準(zhǔn)品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.         根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)VEGF含量。

試劑盒性能

        1.   靈敏度：*小的VEGF 檢測濃度小于30pg/ml。

2.   特異性：可同時檢測重組或天然的豬VEGF。不與豬其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3.   重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

注意事項

        1.   以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致**度誤差及OD值錯誤地升高。

        3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

        4.   本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷。