上海西唐生物科技有限公司 021-55229872, 65333639 www.westang.com
大鼠皮質(zhì)酮(Corticosterone)ELISA試劑盒
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 Corticosterone 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 Corticosterone與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠Corticosterone，形成**復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，*后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，Corticosterone濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Corticosterone濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
| 酶標(biāo)板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
| 10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
| 標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：100ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
| **抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1. 收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復(fù)凍融。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成200ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，**管加標(biāo)本稀釋液900ul，**至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在**管中加入200ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至**管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
標(biāo)本激活方法
1. 將450ul標(biāo)本稀釋液加入到一支1.5ml進(jìn)口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標(biāo)本。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標(biāo)本Corticosterone的水平可能有較大差異，請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度）
5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標(biāo)本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品（已激活）100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入**抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
結(jié)果計算與判斷
1. 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0 ng/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)Corticosterone含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。
試劑盒性能
1. 靈敏度：*小的Corticosterone 檢測濃度小于0.15ng/ml。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠Corticosterone。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于9.6％。
注意事項
1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致**度誤差及OD值錯誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！