大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)ELISA試劑盒
(用于血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))
原理
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 VEGF-C 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 VEGF-C與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠VEGF-C，形成**復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，*后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，VEGF-C濃度與OD值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中VEGF-C濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
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酶標(biāo)板（Coated Wells）
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96孔
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酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate）
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12ml
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10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer）
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12ml
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20×濃縮洗滌液（Wash Buffer）
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50ml
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標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：40ng/ml
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1瓶
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底物工作液（TMB Solution）
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12ml
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**抗體工作液（Biotinylated Antibody）
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6ml
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終止液（Stop Solution）
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12ml
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準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1.10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋?zhuān)ㄊ纠?ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2.收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。血清至少5倍稀釋。
3.標(biāo)準(zhǔn)品液配制：取8個(gè)1.5ml離心管，**管加標(biāo)本稀釋液900ul，**至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在**管中加入40ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出500ul，移至**管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋?zhuān)瑥牡谄吖苤形?00ul棄去。第八管為空白對(duì)照。
4.洗滌液：用重蒸水1:20稀釋?zhuān)ㄊ纠?ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測(cè)程序
1.加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃40分鐘。
2.洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3.每孔加入蒸餾水和**抗體工作液各50ul(空白除外)。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20分鐘。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃10分鐘。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8.每孔加入100ul終止液混勻。
9.30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
結(jié)果計(jì)算與判斷
1.所有OD值建議減除空白值后再行計(jì)算。如空白OD低于0.1，也可以直接計(jì)算。
2.以標(biāo)準(zhǔn)品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)VEGF-C含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。軟件可以向本公司郵件索取。
試劑盒性能
1.靈敏度：*小的VEGF-C 檢測(cè)濃度小于30pg/ml。
2.特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的大鼠VEGF-C。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10％。
注意事項(xiàng)
1.以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.洗滌過(guò)程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致**度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。
3.檢測(cè)時(shí)所有試劑都要恢復(fù)到室溫。板條開(kāi)封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4.試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過(guò)深會(huì)出現(xiàn)絮狀物，屬正常現(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。
5.說(shuō)明書(shū)中試劑盒組成為96T的量，48T的量應(yīng)減半！
6.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！